Мультинаціональне дослідження резистентності до піразинаміду і фторхінолонів

До вашої уваги – переклад нової публікації про результати мультинаціонального дослідження резистентності до піразинаміду та фторхінолонів серед хворих на туберкульоз у країнах з високим тягарем туберкульозу. Стаття була опублікована у LancetInfectDis2016 7 липня цього року: http://www.thelancet.com/pdfs/journals/laninf/PIIS1473-3099(16)30190-6.pdf

Докази, наявні до проведення даного дослідження

Комбінація піразинаміду з фторхінолоном четвертого покоління (моксіфлоксацином або гатіфлоксацином) вважається ефективною у нових схемах лікування туберкульозу, що не містять ріфампіцину, а також у коротких схемах лікування туберкульозу з множиною медикаментозною стійкістю. Розуміння поширеності резистентності до цих препаратів на рівні популяції є критичним для оцінки життєздатності запровадження нових та більш коротких схем лікування у програми по контролю за туберкульозом, як і потреби у тестуванні медикаментозної чутливості, яке повинне супроводжування запровадження цих нових схем. За останні 20 років більш ніж у 150 країнах по всьому світу проводився моніторинг рівня резистентності до найпотужніших протитуберкульозних препаратів – ріфампіцину та ізоніазиду, в рамках рутинного епіднагляду або в ході ситуативних досліджень.

Результати таких досліджень повідомляють ВООЗ. Тестування чутливості до фторхінолонів або піразинаміду не виконується рутинно в кожному випадку захворювання на туберкульоз в рамках нагляду за медикаментозною резистентністю. Тому на сьогодні немає результатів нагляду на рівні популяції по резистентності до піразинаміду та фторхінолонів четвертого покоління (моксифлоксацину або гатіфлоксацину) для всіх хворих на туберкульоз. Ми провели пошук в базах даних MEDLINE (за період з 1966 по 20 березня 2016 року) та Embase (за період з 1980 по 20 березня 2016 року), з використанням ключових слів «туберкульоз», «медикаменти», «резистентність» та «нагляд», з обмеженням до результатів англійською, французькою та іспанською мовами. Також ми провели пошук в базі глобальних проектів ВООЗ по нагляду за резистентністю до протитуберкульозних препаратів, яка містить результати усіх опублікованих та неопублікованих досліджень резистентності до протитуберкульозних препаратів та епіднагляду, що проводилися в усьому світі (за п еріод з 1994 по 20 березня 2016 року).

Додана вартість дослідження

Це дослідження представляє результати першого дослідження на рівні популяції, в якому вивчалися рівні резистентності до піразинаміду, офлоксацину, левофлоксацину, моксифлоксацину та гатіфлоксацину серед хворих на туберкульоз в країнах з високим тягарем туберкульозу та туберкульозу з множинною медикаментозною резистентністю. При проведенні рутинних наглядів та при рутинному веденні хворих тестування резистентності до цих препаратів обмежується певними групами хворих, наприклад, хворих на туберкульоз з резистентністю до ріфампіцину або з лікуванням туберкульозу в анамнезі. Цей набір даних, таким чином, проливає світло на базову долю резистентності до цих препаратів на рівні популяції, а особливо – серед нових випадків туберкульозу. Наша робота допомагає зрозуміти здійсненність запровадження нових схем лікування туберкульозу та стратегій тестування медикаментозної чутливості в цих регіонах.

Застосування наявних даних

Наші результати мають програмне застосування як при розробці стратегій лікування, так і в пошуці можливостей для інвестицій в розробку та впровадження нових діагностичних технологій. Ця робота демонструє, що наявність резистентності до ріфампіцину, яка сьогодні легко виявляється завдяки широкій доступності нових швидких методів молекулярної діагностики, повинна привернути увагу до вірогідності одночасної наявності резистентності до піразинаміду та, у деяких випадків, до фторхінолонів раннього покоління. Водночас, резистентність до фторхінолонів останнього покоління, яка мала б переломну клінічну значимість, ще не є поширеним явищем. Цей результат є дуже важливим для розробки стандартних схем лікування для різних регіонів, керівництв для розробників схем та виробників засобів діагностики. Результати нашого дослідження допомагають відповідальним за розробку  політики в охороні здоров’я у приорітизації нових  схем та алгоритмів тестування чутливості до медикаментозних препаратів, а також їх впровадження, та закликають до перегляду потреб у епідеміологічному нагляді для забезпечення наявності більших та кращих даних, необхідних для розуміння частоти резистентності до піразинаміду та фторхінолонів у різних епідеміологічних регіонах та групах пацієнтів.

Дизайн та учасники дослідження

Дослідження медикаментозної резистентності – це дослідження особливого дизайну, які вимірують резистентність до протитуберкульозних препаратів у репрезентативній вибірці зареєстрованих пацієнтів з легеневим туберкульозом. Більш детальна інформація щодо дизайну досліджень медикаментозної резистентності надається інде.14 Дані, надані у цій статті, були зібрані з ізолятів у хворих на туберкульоз, що взяли участь в дослідженнях національного рівня в Азербайджані (2013),15 Бангладеш (2011),16 Пакистані (2013),17 а також в дослідженнях піднаціонального рівня у м. Мінськ, Білорусь (2010)18 та і провінціях Гаутенг та КваЗулу Натал в Південно-Африканській Республіці (2014).19 Ці країни були обрані через те, що вони представляють різні програмні та епідеміологічні контексти. В усіх цих країнах високий тягар туберкульозу, причому показник захворюваності варіюється від 58 на 100 000 та 834 на 100 000 осіб, а доля випадків туберкульозу з резистентністю до ріфампіцину складає від 4,9% до 49,1% (додаток). В усіх цих країнах неускладнений туберкульоз лікується в секторі громадського здоров’я за стандартною схемою, рекомендованою ВООЗ.8 У Бангладеш та Пакістані, наприклад, значна кількість пацієнтів лікується у приватних практиків різними комбінаціями препаратів та схемами лікування.

 

Процедури

Зразки мокротиння, зібрані у пацієнтів, що брали участь в цих дослідженнях, пройшли бактеріологічне дослідження та тест медикаментозної чутливості до протитуберкульозних препаратів першого ряду в Національній туберкульозній референс-лабораторії або за методом пропорцій Левенштейна-Йєнсена (Азербайджан, Бангладеш, Пакістан) або MGIT 960 (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA; Білорусь та ПАР). Після цього ізоляти було відправлено у вибрані супранаціональні референс-лабораторії по туберкульозу ВООЗ,  в яких було виконано дослідження резистентності до піразинаміду, офлоксацину, левофлоксацину, моксифлоксацину та гатіфлоксацину. Методи лабораторної діагностики були стандартизовані, всі лабораторії успішно пройшли контроль якості досліджень резистентності до піразинаміду та фторхінолонів. Резистентність до піразинаміду оцінювалася шляхом секвенції для виявлення мутацій гену pncA (Rv2043c), відповідальних за резистентність,  та промоутера, що знаходиться в міжгенному регіоні Rv2044c–Rv2043c. Застосовувалися технології, які вже використовуються у супранаціональних референс-лабораторіях, а саме, секвенція ДНК за методом Сенгера з використанням 3730xl (Thermo Fisher Scientific, MA, USA), секвенція нового покоління з використанням платформ Hiseq 2500 та MiSeq (Illumina, San Diego,  CA,  USA), а також з використанням апарату Ion Torrent PGM (Thermo Fisher Scientific), згідно інструкцій виробника. Роль генних мутацій у передачі резистентності була присвоєна на підставі наявної наукової літератури20,21 та матеріалів з баз даних он-лайн.22–24 Крім цього, на апараті MGIT  960 був проведений фенотипний тест чутливості до піразинаміду при коонцентрації 100,0 мкг/мл з використанням набору MGIT-PZA 25 для усіх ізолятів з раніше незареєстрованими мутаціями. Роль цих мутацій у передачі резистентності була присвоєна згідно з фенотипом.

Тестування чутливості до фторхінолонів проводилося за допомогою системи MGIT та запасів розчинів препаратів, приготованих на місці. Усі ізоляти було протестовано на чутливість до офлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл та моксифлоксацину в концентрації 0,5 мкг/мл. Усі ізоляти, в яких було виявлено резистентність до офлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл або моксифлоксацину в концентрації 0,5 мкг/мл, пройшли подальше тестування на резистентність до левофлоксацину в концентрації 1,5 мкг/мл та моксифлоксацину та гатіфлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл. Тестування резистентності до моксифлоксацину проводилося у двох концентраціях, оскільки концентрація 0,5 мкг/мл вважається епіміологічним порогом, а 2,0 мкг/мл вважається клінічно переломною,25 визначеною як концентрація антибіотику, якої можна досягнути у біологічних рідинах або органах-мішенях під час оптимальної терапії. Ізоляти, у яких була виявлена чутливість до офлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл та моксифлоксацину в концентрації 0,5 мкг/мл, вважалися чутливими до левофлоксацину в концентрації 1,5 мкг/мл та моксифлоксацину та гатіфлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл.

 

Результати

В даному ретроспективному дослідженні вдалося отримати повторне зростання не від усіх ізолятів, зібраних під час первинного дослідження. Доля штамів в оригінальному дослідженні, які не змогли отримати через неефективне зростання, була різною у різних країнах: 5% (41/789) в Азербайджані, 29% (389/1344) у Бангладеш, 10% (23/224) у Білорусі, 6% (89/1592) у Пакістані та 6% (52/929) в провінції Гаутенг та 9% (65/756) в провінції КваЗулу Натал в ПАР. В групі осіб, в зразках мокротиння яких не відбулося повторного зростання мікобактерій, не відмічалося значних відмінностей від групи осіб з життєздатними зразками за віком, статтю, анамнезом лікування або статусом резистентності до ріфампіцину (дані не наведені).

Розподіл частоти резистентності до піразинаміду за регіоном, лікуванням туберкульозу в анамнезі та чутливістю до ріфампіцину наведено у Таблиці 1.

Загалом 4972 хворих у 5 країнах пройшли дослідження резистентності до піразинаміду. Рівні резистентності значно відрізнялися поміж усіма випадками туберкульозу (3,0–42,1% в регіонах, що брали участь в дослідженні). Найнижчі рівні спостерігалися у Бангладеш, Пакістані та ПАР. В усіх країнах та в усіх групах пацієнтів різниця у частоті резистентності до піразнаміду та частоті резистентності до ріфампіцину не мала статистичної значимості (додаток); єдиним винятком був Пакістан, де рівень резистентності до піразинаміду був значно нижчим, аніж рівень резистентності до ріфампіцину в усіх групах пацієнтів (p<0·0001). Частота резистентності до піразинаміду була значно вищою у пацієнтів з ріфампіцин-резистентним туберкульозом (у порівнянні з хворими на туберкульоз, чутливий до ріфампіцину), а також серед хворих з лікуванням туберкульозу в анамнезі (у порівнянні з пацієнтами, що раніше не лікувалися від туберкульозу) майже в усіх регіонах.

Було проведено тестування 5015 пацієнтів для визначення резистентності до фторхінолонів. Частота резистентності до окремих препаратів групи фторхінолонів в залежності від регіону, лікування в анамнезі, а також чутливості до ріфампіцину наведена у Таблиці 2 (офлоксацин), Таблиці 3 (левофлоксацин), Таблиці 4 (моксифлоксацин), та Таблиці 5 (гатіфлоксацин). В окремих країнах відсоток усіх випадків з резистентністю був схожим для трьох препаратів  (офлоксацин, левофлоксацин та моксифлоксацин 0,5 мкг/мл). В різних країнах частота резистентності для всіх випадків варіювалася від 1,0% до 16,6% (офлоксацин), 0,5% до 12,4% (левофлоксацин) та 0,9%  до 14,6%  (моксифлоксацин 0,5 мкг/мл). Напроти, показники резистентності до моксифлоксацину 2 мкг/мл та гатифлоксацину  для всіх випадків були 0,0–5,1% та 0,0–2,5%, відповідно, і тому були нижчими та з меншим діапазоном.

 

 

Немає резистених штамів

Немає чутливих штамів

% резистеності

Офлоксацин (2,0 мкг/мл)

282

0

100%

Левофлоксацин  (1·5 мкг/мл)   

245

37

87%

Моксифлоксацин (0·5 мкг/мл)   

203

79

72%

Моксифлоксацин (2,0 мкг/мл)

19

263

7%

Гатіфлоксацин (2,0 мкг/мл)

7

275

2%

 

Таблиця 6: Перехресна резистентність в групі фторхінолонів

В усіх країнах, окрім Бангладеш та Пакістану, частота нових випадків резистентності до фтоорхінолонів була значно нижчою, ніж частота випадків резистентності до ріфампіцину. В усіх регіонах серед випадків туберкульозу з резистентністю до ріфампіцину була виявлена вища частота резистентності до офлоксацину, у порівнянні з випадками туберкульозу, чутливого до ріфампіцину, але цей зв’язок не був значним  в жодному регіоні у порівнянні з іншими препаратами групи фторхінолонів. І нарешті, ми спостерігали вищу резистентність у випадках повторного лікування, аніж в нових випадках, але цей результат мав статистичну значимість лише у половині або менше з шести регіонів.

Із 303 ізолятів, резистентних до офлоксацину, що брали учать у даному дослідженні, результати тесту чутливості до інших препаратів групи фторхінолонів були наявними для 282 (93%) ізолятів. Частота перехресної резистентності ізолятів з резистентністю до офлоксацину представлена в Таблиці 6; цей показник є високим для левофлоксацину (87%), та моксифлоксацину при тестуванні в концентрації 0,5 мкг/мл (72%). Однак, показник перехресної резистентності до офлоксацину та моксифлоксацину (при тестуванні в концентрації 2,0 мкг/мл; 7%), та гатіфлоксацину (2%) був дуже низьким.

Обговорення

У цьому мультинаціональному дослідженні ми представляємо перші результати на рівні популяції дослідження частоти резистентності до піразинаміду та фторхінолонів серед хворих на туберкульоз у країнах з високим тягарем. При рутинному епіднагляді та веденні випадків тестування резистентності до цих препаратів обмежується певними групами хворих, зокрема, хворих на ріфампіцин-резистентний туберкульоз або хворих з лікуванням туберкульозу в анамнезі. Ці дані проливають світло на базові рівні резистентності та життєздатність впровадження нових схем лікування туберкульозу та стратегії проведення тесту медикаментозної чутливості у цих регіонах.

Піразинамід є важливим компонентом найчастіше вживаних коротких схем лікування туберкульозу, рекомендованих ВООЗ для призначення в усьому світі,8 а також схем лікування МРТБ препаратами другого ряду.11 В країнах, що брали участь в дослідженні, не було виявлено значної різниці у показниках резистентості до піразинаміду та ріфампіцину, за єдиним винятком Пакістану, де показник резистентності до піразінаміду був значно нижчим, аніж показник резистентності до ріфампіцину. Крім цього, в усіх регіонах був виявлений значний зв’язок резистентності до піразинаміду з резистентністю до ріфампіцину, що підтверджує той факт, що значна більшість випадків резистентності до піразинаміду приходиться на долю хворих з резистентністю до ріфампіцину, яких можна швидко виявити за допомогою існуючих засобів молекулярної діагностики. Однак, значна доля хворих на ріфампіцин-резистентний туберкульоз (19–63%, як показують результати цього дослідження; Таблиця 1) можуть мати чутливість до піразинаміду. З цих даних можна зробити два важливих висновки. По-перше, схеми, що не містять ріфампіцин, але містять піразинамід, можуть бути не ефективнішими за існуючі схеми лікування туберкульозу препаратами першого ряду для лікування на рівні популяції, якщо рівні резистентності до ріфампіцину та піразинаміду є схожими. По-друге, дуже важливо швидко визначити хворих, яким може бути корисною схема з піразинамідом, та тих, для яких ця схема буде неефективною. Для такого розмежування необхідні швидкі тести для діагностики резистентності до ріфампіцину, яких на сьогодні немає.26

Як і у випадку з піразинамідом, рівні резистентності до офлоксацину були значно пов’язані з резистентністю до ріфампіцину в усіх регіонах. Рівні резистентності до офлоксацину, левофлоксацину та моксифлоксацину в концентрації 0,5 мкг/мл були схожими в усіх регіонах та значно нижчими за рівні резистентності до ріфампіцину в Азербайджані та Білорусі (незважаючи на високу поширеність МРТБ в обох регіонах). Напроти, у Пакістані (та в меншому ступені у Бангладеш) частотат резистентності до фторхінолонів була вищою за частоту резистентності до ріфампіцину – тривожний результат. Цей результат, можливо, випливає з поширеного використання фторхінолоніів у багатьох регіонах Азії для лікування не тільки туберкульозу, а й пневмоній та неускладнених інфекцій дихальних шляхів загалом.27 У Східній Європі та Південній Азії резистентність до фторхінолонів в основному обмежується групою пацієнтів з резистентністю до ріфампіцину, що є наслідком використання антибіотиків цієї групи у лікуванні туберкульозу лише в рамках лікування препаратами другого  ряду. У ПАР, хоча фторхінолони і використовуються для лікування пневмоній, це має місце в основному в приватному секторі, який часто недоступний для хворих на туберкульоз.

Показник резистентності до фторхінолонів останнього покоління (моксифлоксацин та гатіфлоксацин в концентрації 2,0 мкг/мл) в усіх країнах був дуже низьким, навіть серед хворих з резистентністю до ріфампіцину. Цей результат можна частково пояснити все ще нечастим застосуванням фторхінолонів четвертого покоління у більшості країн. Однак, це також може бути відображенням недооціненності реальної проблеми з точки зору недостатнього розуміння зв’язку між критичною концентрацією при проведенні тесту на чутливість до деяких фторхінолонів в лабораторії та клінічних результатів для пацієнтів. Свіжі дані вказують на те, що критична концентрація 2,0 мкг/мл на рідких середовищах може бути надто високою.28,29

Очікувалося виявлення широкої перехресної резистентності до офлоксацину, левофлоксацину та моксифлоксацину в концентрації 0,5 мкг/мл (Таблиця 6); це співпадає з результатами генетичних досліджень.30 Важливо, що частота перехресної резистентності до офлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл та моксифлоксацину в концентрації 2,0 мкг/мл або гатіфлоксацину залишається низькою, але частково це може бути наслідком надто високих критичних концентрацій, як обговорювалося вище. Ці результати підкріплюють сучасну рекомендацію щодо використання моксифлоксацину або гатіфлоксацину у лікуванні МРТБ.11

У нашого дослідження було два основних обмеження. Перше відноситься до його ретроспективного характеру. Дослідження були розроблені для визначення частки МРТБ, а не долі резистентності до піразинаміду або фторхінолонів. Як наслідок, при виявленні дуже низьких рівнів резистентності (наприклад, до моксифлоксацину в концентрації  2,0 мкг/мл та гатіфлоксацину), оціночні дані мали широкий довірчий інтервал (Таблиці 4, 5). Хоча було очевидним, що більшість випадків з резистентністю до ріфампіцину та випадків лікування туберкульозу в анамнезі матимуть вищі рівні резистентності до більшості препаратів, не в усіх регіонах можна було зафіксувати статистично значиму різницю через недостатню силу доказів. Крім цього, певний відсоток оригінальних штамів не підлягав повторному зростанню – загалом до 10%, а в Бангладеш – 29%. Для заміщення були використані розрахункові дані.14

Друге обмеження стосується лабораторного компоненту. Хоча для тестування фенотипу використовувалися критичні концентрації, рекомендовані ВООЗ25, останні докази вказують на те, що деякі з цих порогових значень не є ідеальними.20,28–31 Зокрема, низькі виявлені рівні резистентності до моксифлоксацину та гатіфлоксацину можуть бути наслідком надмірно високих контрольних точок. При оцінці рівня резистентності до піразинаміду ми покладалися в основному на мутації гену pncA, щоб уникнути проблем, пов’язаних з субоптимальною відтворюваністю дослідження фенотипу та непевностей вибору найбільш оптимальної критичної концентрації.20,25,31 Очікується, що мутації гену pncA відповідають за близько 85–90% від усіх випадків резистентності до піразинаміду,32,33 в результаті чого наше дослідження може дещо недооцінити тягар резистентності. Крім цього, хоча використовувалися тільки методи, визнані ВООЗ, а всі лабораторії пройшли контроль якості досліджень до початку проекту, можна очікувати певну варіабельність результатів в різних лабораторіях.

Наше дослідження показало, що наявність резистентності до ріфампіцину, яку нескладно виявити за допомогою широко доступних методів швидкої молекулярної діагностики, повинна привернути увагу до одночасної наявності резистентності до піразинаміду та, в деяких регіонах, до фторхінолонів раннього покоління. В той же час, резистентність до фторхінолонів останнього покоління в клінічно критичній концентрації ще не є поширеною. Ці результати є важливими для розробки стандартних схем лікування для різних регіонів, керівництв для розробників схем та виробників засобів діагностики, а також для запровадження існуючих схем лікування туберкульозу з медикаментозною стійкістю (наприклад, коротких схем).11         Слід брати до уваги ці дані при виборі приорітетності та запровадженні нових схем та алгоритмів тестування медикаментозної чутливості. Також слід переглянути підходи до епідеміологічного нагляду таким чином, щоб мати доступ до більш якісних даних для розуміння рівнів резистентності до піразинаміду та фторхінолонів у різних епідеміологічних регіонах та групах пацієнтів. Без цієї інформації існує високий ризик запровадження неефективних схем лікування, які не виліковуватимуть хворих та можуть сприяти посиленню медикаментозної резистентності, включаючи резистентність до нових препаратів. Рутинне дослідження медикаментозної чутливості в усіх випадках та швидка розробка технологій секвенції для виявлення генних мутацій, що несуть резистентність до якомога більшої кількості препаратів, є необхідними умовами оптимізації лікування та профілактики розвитку додаткової медикаментозної резистентності.